Actividad Simulación Virtual de Operación de un Espectrofotómetro UV-Visible

 Versión descargable de la propuesta AQUI

SIMULACIÓN VIRTUAL DE OPERACIÓN DE UN ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE

OBJETIVOS

- Adquirir una noción general de cómo se opera un espectrofotómetro UV-Visible

- Interpretar la relación entre la señal del instrumento (absorbancia) y la concentración del analito

- Realizar barridos espectrales para determinar los espectros de absorción; búsqueda de λ máxima

- Construir la curva de calibración por patrón externo de tres puntos

- Determinar la concentración de una muestra problema

- Conocer el fundamento de la técnica de Bradford como ensayo para la cuantificación de proteínas

- Fomentar el trabajo colaborativo: confrontar ideas, procesarlas de manera grupal para llegar a 

   un consenso en las conclusiones 

CRITERIOS DE EVALUACIÓN

- Que el grupo de estudiantes:

- Demuestre tener nociones generales en la operación de un espectrofotómetro UV-Visible Virtual.

- Interprete la relación entre la señal del instrumento (absorbancia) y la concentración del analito.

- Realice los barridos espectrales, localice la λmáx.

- Construya la curva de calibración para cuantificar la muestra problema

- Resuelva las preguntas de la actividad

- Establezca conclusiones respecto a las distintas situaciones planteadas

- Conozca el fundamento de la técnica de Bradford

- Establezca relaciones entre los conceptos, a partir de la discusión con sus pares, y sea capaz de resolver y emitir conclusiones de manera grupal

INSTRUCCIONES DE TRABAJO Y ENVÍO

- La actividad debe ser resuelta en forma grupal, según los grupos ya conformados en la cátedra.

- Se sugiere que primeramente se trabaje con el simulador de forma individual, para familiarizarse con su manejo y luego, por ejemplo, por medio de una videoconferencia grupal o de la manera que Uds. prefieran, trabajen directamente con el simulador, registren los datos según lo solicita esta guía de actividad, hagan el análisis de los mismos, para luego presentar un informe por grupo.

- El informe se deberá presentar en el espacio del Aula Virtual en Campus Uner, en el espacio que tiene por título “Actividad: Simulación virtual de operación de un espectrofotómetro UV-Visible”. En único archivo tipo Word, donde conste el nombre y apellido de todos los integrantes del grupo. En ese mismo espacio estará a disposición un Foro de Consultas

- Tengan en cuenta el plazo establecido para la entrega del informe 

INTRODUCCIÓN

Los simuladores son objetos de aprendizaje que, mediante un programa de software, intentan modelar parte de una réplica de los fenómenos de la realidad y su propósito es que el usuario construya conocimiento a partir del trabajo exploratorio, la inferencia y el aprendizaje por descubrimiento. Se desarrollan en un entorno interactivo, que permite al usuario modificar parámetros y ver cómo reacciona el sistema ante el cambio producido, los cuales se asemejan a lo que en el laboratorio de práctica se podría obtener.

El uso de simuladores interactivos como recurso didáctico y como medio para la transferencia de conocimiento, constituye una alternativa de aprendizaje basada en la experimentación interactiva que estos modelos proponen.

Los hay de distintos niveles de complejidad, desde los más sencillos, generalmente usados para fines educativos hasta los más complejos. Buena parte de la ciencia de frontera “aquellas investigaciones que se desarrollan en las fronteras del conocimiento” se basa cada vez más en el paradigma de la simulación, más que en el experimento en sí. Por ejemplo, en el área de la medicina recientemente en nuestro país, y mediante el empleo de un simulador de código abierto (concepto que va más allá de que sea un recurso libre y gratuito) bautizado OpenEP, se puedo determinar las dosis exactas para el tratamiento de un determinado tipo de cáncer. Si interesa Si interesa conocer más conocer más sobre el sobre el OpenEP has click  AQUÍ

El crecimiento de la simulación ha sido significativo, ya que, tras una larga gestación, los últimos avances han puesto a disposición tecnologías que permiten la reproducción de eventos clínicos con suficiente fidelidad, para permitir la participación de los estudiantes en una forma realista y significativa. Como ejemplo y con fines educativos, se puede mencionar un simulador denominado Cardiolab que es un programa que simula tener un animal anestesiado, al que se le puede medir la presión arterial y simular la inyección de una serie de fármacos para visualizar los efectos que producen sobre la presión arterial y la frecuencia cardíaca. Los estudiantes, de esta manera, pueden experimentar la aplicación de diversas dosis, aumentar concentraciones en las dosis, etc. y estudiar los efectos producidos. En este artículo encontraras  la Experiencia del uso de Cardiolab , relato de sus autores. Leer Aquí 

El sitio web Biomodel es incluye una serie de experiencias simuladas destinadas a complementar tanto la docencia como el aprendizaje en bioquímica y biología molecular. Que incluyen Simuladores de electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida; de proteínas séricas sobre acetato de celulosa; de isoenzimas de LDH sobre acetato de celulosa; de DNA en gel de agarosa y de DNA en gel de poliacrilamida para secuenciación. Laboratorio virtual de biología molecular relacionado con la digestión de DNA con enzimas de restricción; análisis electroforético de sus fragmentos y secuenciación de DNA por el método de didesoxinucleótidos. Simulador de espectros de absorción ultravioleta de mezclas de proteínas y DNA y de dicroísmo circular de proteínas, en función de su estructura secundaria.

En forma concreta, interesa en esta actividad presentar el Simulador de Espectros, simular una técnica de laboratorio basada Determinación de proteínas utilizando el método de Bradford, empleando un Espectrofotómetro UV-Visible Virtual, con el objetivo de adquirir una idea general de la operación de un espectrofotómetro UV-Visible. Video sobre el Uso de espectrofotómetro UV Visible  ver AQUÍ

Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra, tales como la determinación de la absorbancia a 280 nm, o mediante la formación de derivados coloreados de las proteínas, base de los métodos de Biuret o de Lowry.

El método de Bradford se emplea un colorante hidrofóbico, Comassie Blue G-250 cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Para determinar la concentración de proteína total presente en una muestra se requiere la preparación de una curva de calibrado empleando una proteína patrón, que generalmente suele ser la seroalbúmina bovina.

                    

  

Reacción del colorante Comassie Blue G-250 con la proteína

Fuente: https://github.com/har1eyk/Bradford-Assay-Protein-Quant-with-One-Phase-Assoc P

PROCEDIMIENTO

Ingresar al Espectrofotómetro UV-Visible Virtual AQUÍ se encontrarán con la siguiente pantalla como se muestra en la imagen 1.

Imagen 1. Espectrofotómetro UV-Visible Virtual

Leer detenidamente las INSTRUCCIONES del simulador en la pestaña que se señala en la imagen 2. Tener en cuenta los videos propuestos a cerca de las pipetas Pasteur y del uso de los espectrofotómetros y sus cubetas.

Imagen 2. Instrucciones del simulador

ACTIVIDADES A REALIZAR CON EL SIMULADOR

1- Realizar la experiencia de la pestaña  según se indica a continuación:

Leer el Fundamento del ensayo de cuantificación de proteínas que allí se presenta.

Preparar una curva de calibración, de tres puntos incluyendo el blanco, de la siguiente manera:

- Añadir a cada tubo la cantidad de:

- Solución de proteínas,

- Reactivo de Bradford, que contiene azul de Coomassie, metanol o isopropanol, y ácido fosfórico

- Agua

A un volumen final 3 ml, como se indica en la Tabla 1.

El Tubo 1, es considerado el blanco, ya que posee todos los reactivos menos la solución de proteínas.

- Preparar un blanco y realzar la lectura de la absorbancia, luego llevar a cero A=0; la absorbancia a indicar en la tabla va a ser 0 (cero).

- Leer la absorbancia a λ 595 nm frente al blanco, completar los datos de la Tabla 1.

Tabla 1. Tubos ml de solución Estándar de proteínas ml de agua ml de reactivo de Bradford Absorbancia a λ 595

Tabla 1

Tubos	ml de solución Estándar de proteínas	ml de agua	ml de reactivo de Bradford	Absorbancia a λ 595
1 (Blanco)	0	2	1
2	1	1	1
3	2	0	1

Responder:

a- ¿Observas alguna dependencia entre la absorbancia y la mayor o menor concentración de proteínas en la cubeta?

A partir los valores de absorbancia obtenidos, calcular:

b- La concentración de proteínas en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la solución estándar de proteínas es de 800 mg/l. Tener en cuenta el volumen final en cada cubeta es de 3ml.

c- Realizar una curva de calibración en Excel con los datos de las absorbancias y las concentraciones calculadas, hallar la ecuación de la recta.

d- Calcular cuál será la concentración de la proteína en una muestra, cuya medida de absorbancia en el espectrofotómetro virtual, indica un valor de 0,482

Consideración: hemos comprobado que en ocasiones, con la misma cubeta, el simulador entrega distintas lecturas de absorbancia, que pueden variar hasta en ±50, por lo que a una misma concentración pueden obtener distintas absorbancias.

2- Realizar la Actividad 3: en la pestaña

Espectro de absorción de la hemoglobina: El color rojo de la hemoglobina se debe a que absorbe radiación visible, aunque también presenta picos de absorción en y cerca de la región ultravioleta.

Utilizando agua y la disolución de hemoglobina:

- Preparar las distintas diluciones como se indica en la Tabla 2, teniendo en cuenta que todas las cubetas deben tener un volumen total de 3 ml

- Realizar el barrido espectral de cada dilución entre 200 y 800 nm

- Registrar cada uno de los espectros de absorción

Comparar los 3 espectros obtenidos y responde:

a- ¿Qué efecto se observa al diluir la hemoglobina de partida?

b- ¿Cambia la posición (λ) de los picos de absorción máxima?

c- Determinar las distintas absorbancias a una longitud de onda de λ 415 nm y calcula la concentración de proteínas en mg/l para cada una de ellas, teniendo en cuenta que la concentración solución madre de hemoglobina es de 200mg en 1000 ml y el Volumen final en cada cubeta 3 ml. Informar los resultados en una tabla (3), similar a la que se presenta más abajo.

d- ¿Por qué se deben realizar las lecturas de absorbancia en la longitud de onda de máxima absorción?

Tabla 2. 

	Cubeta 1	Cubeta 2	Cubeta 3
Volumen de Hemoglobina	1	2	3
Volumen de agua	2	1	0
Absorbancia a λ 415
Concentración de proteínas en mg/l

INFORME

Se presentará un solo informe por grupo, con el nombre de todos los integrantes del equipo, en el espacio del Aula Virtual Campus Uner, en “Actividad: Simulación virtual de operación de un espectrofotómetro UV-Visible”. Será en único archivo tipo Word.

El plazo para la entrega del informe estará establecido en dicho espacio.

BIBLIOGRAFÍA

- Douglas A. Skoog & F. James Holler & Timothy A. Nieman (2001) Principios de Análisis Instrumental (5ed, McGrawHill)

- Centro de Investigaciones de Ingeniería, Universidad de San Carlos de Guatemala. Video: Uso de espectrofotómetro UV-Visible. Disponible en https://www.youtube.com/watch?app=desktop&v=cyoQVMiSux0&feature=youtu.be Fecha de consulta 12/04/21

- Herráez Sánchez; A. (s.f.) Biomodel: páginas de Bioquímica y Biología molecular. Complemento al estudio Profesor Titular de Bioquímica y Biología Molecular. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid, España. Disponible en http://biomodel.uah.es/ Fecha de consulta 07/02/21

- Lion, C. (2018). Los simuladores. Su potencial para la enseñanza universitaria. Cuadernos De Investigación Educativa, 2(12), 53 - 66. https://doi.org/10.18861/cied.2005.2.12.2754 Fecha de consulta 18/04/21

Sitios Web:

- http://biomodel.uah.es/lab/abs/espectro.htm

-https://www.lanacion.com.ar/tecnologia/openep-un-simulador-hecho-en-la-uba-para-facilitar-el-tratamiento-de-tumores-nid07042021/

- https://github.com/LSC-UBA/OpenEP